Bei der Vorbereitung resp. Extraktion wird die klinische Probe unter möglichst optimalen Bedingungen zu einem nukleinsäurehaltigen Extrakt verarbeitet, der anschliessend problemlos zum Beispiel mit der PCR weiterverarbeitet werden kann. Dabei unterscheiden sich die Extraktionsprotokolle vor allem nach Art der klinischen Probe und Art der Zielsequenz. Bei PCR Tests zum Nachweis von Krankheitserregern beispielsweise sollte die Erreger-Nukleinsäure möglichst schonend und ohne Verlust aus der klinischen Probe extrahiert werden. Bei Tests zum Nachweis von Veränderungen in der humanen DNA sollten physikalische Einwirkungen wie Scherkräfte oder längeres Erhitzen vermieden werden. Im weiteren ist RNA als Zielmolekül der PCR sehr viel problematischer aufzuarbeiten als DNA, da RNA weniger stabil ist und auch sehr leicht durch RNAsen abgebaut wird.

Zur Extraktion der Nukleinsäuren stehen sehr unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Meist werden physikalische Methoden wie Hitze und Ultraschall eingesetzt. Als chemische Hilfsmittel dienen Detergenzien wie Triton, Tween oder SDS und / oder andere chemische Substanzen, aber auch Enzyme wie Proteinase K oder Lysozym. Physikalische und chemische Methoden werden oft kombiniert. Dabei werden Humangewebe und -zellen, aber auch Erregerzellen lysiert und die Nukleinsäuren werden freigesetzt. Für gewisse Tests kann dieses grobe Lysat bereits direkt für die PCR eingesetzt werden. Bei anderen Testsystemen schliesst ein Reinigungsschritt an, um Inhibitoren der PCR zu entfernen oder die Nukleinsäure gegen Abbau zu schützen. Ein typisches Beispiel einer Reinigungsmethode ist der Einsatz von Guanidinisothiocyanat mit anschliessendem Verwenden einer Silicasäule. Jedes Reinigungsverfahren verursacht indessen aber auch einen gewissen Verlust an Nukleinsäuren.

Die Probenextrakte können je nach Reinheitsgrad bei -20°C einige Wochen bis zu einigen Jahren gelagert werden.

Zur Probenvorbereitung und Extraktion von klinischen Proben werden sehr unterschiedliche Protokolle verwendet, die kaum automatisiert werden können. Ausserdem muss eine Kontamination der Proben möglichst vermieden werden. Es ist deshalb unerlässliche Bedingung, dass diese Arbeiten nur mit entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden.

Die Polymerase Kettenreaktion (PCR für „polymerase chain reaction“) führt enzymatisch und in vitro zu einer exponentiellen Amplifikation (Vermehrung) eines definierten DNA-Fragmentes (siehe Grafik).

Als Startmaterial benötigt man geringste Mengen an DNA (menschliche, bakterielle, virale u.s.w.). Zur Start DNA (Template DNA) werden zwei kurze synthetische Oligonukleotide (Primers), zusammen mit einer hitzestabilen DNA-Polymerase und den Bausteinen der DNA (Nukleotide) zugegeben. Die Sequenz der Oligonukleotide ist so gewählt, dass sich ihre jeweiligen komplementären Sequenzen in der Ziel DNA auf den gegenüberliegenden Strängen der Doppelhelix in einer Entfernung von einigen hundert bis wenigen tausend Basenpaaren befinden. Demzufolge muss also die Nukleotidsequenz des zu amplifizierenden Fragmentes bzw. seiner unmittelbaren Nachbarschaft bekannt sein.

Die eigentliche PCR ist ein sich wiederholender Dreischrittprozess (Grafik)mit 3 verschiedenen Temperaturen. Im ersten Schritt (Denaturierung) wird die DNA durch Hitze (ca. 95C) denaturiert, d. h. in ihre einzelsträngige Form überführt. Im zweiten Schritt (Annealing) lässt man die im Ueberschuss vorliegenden Oligonukleotide durch Temperatursenkung an ihre komplementären Sequenzen der DNA hybridisieren (ca. 50-65C).Im dritten Schritt (Extension=Verlängerung) der Reaktion erkennt die DNA-Polymerase diese kurzen doppelsträngigen Elemente als Startsignale (Primers) und beginnt, die benachbarte einzelsträngige DNA komplementär zum Doppelstrang in der 5’ --> 3’ Richtung zu ergänzen (72C). Am Ende des dritten Schrittes, und damit des ersten Zyklus der PCR, ist die DNA dieser Region also verdoppelt worden. Durch Wiederholung dieser Zyklen lässt sich somit eine exponentielle Amplifikation der DNA zwischen den beiden Oligonukleotiden erreichen. Nach etwa 30 Zyklen erhält man demnach aus einem einzigen Ausgangsmolekül bis zu einer Milliarde Kopien.

Durch die sehr grosse Sensitivität und das exponentielle Prinzip der enzymatischen Reaktion und die kurze Dauer der Analyse (Grafik) ist die PCR ein hervorragendes, kaum mehr zu ersetzendes Werkzeug der Diagnostik aber auch der Forschung geworden.

Die Genome einiger klinisch relevanter Viren (z. B. Hepatitis C Virus, Enteroviren) bestehen anstelle von DNA aus RNA. Die DNA-Polymerase kann RNA als Startmaterial nicht verwenden. Mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase wird die RNA in DNA umgeschrieben die dann für die PCR verwendet werden kann (Grafik).

Mit dieser Analyse kann einerseits das Amplifikat mit einer spezifischen Sonde nachgewiesen resp. bestätigt werden (z.B. bei E. coli das VT1 Toxin), anderseits können Amplifikate dadurch weiter charakterisiert werden (z.B. Unterscheidung Bartonella henselae / Bartonella quintana). Die amplifizierte DNA, mit Digoxigenin markiert, wird denaturiert (einzelsträngig) und mit komplementären einzelsträngigen Gensonden hybridisiert. Als Gensonden dienen chemisch synthetisierte Oligonukleotide die mit Biotin markiert sind. Die stabilen Hybride werden durch Biotin-Avidin Kopplung an die Mikrotiterplatte gebunden und mittels EIA durch eine Farbreaktionen sichtbar gemacht.

Die amplifizierte DNA wird mit der gewünschten Restriktionsendonuklease verdaut und die Spaltprodukte elektrophoretisch aufgetrennt. Punktmutationen oder DNA-Polymorphismen erkennt man durch die unterschiedliche Fragmentlänge (Grafik).

Mit dem „Amplification Refractory Mutation System“ (ARMS)-PCR ist es möglich, verschiedene DNA-Polymorphismen selektiv zu amplifizieren und zu unterscheiden (Grafik). Die Detektion der dabei gebildeten PCR-Produkten erfolgt mit der Agarosegelelektrophorese.

Unter Real Time PCR Anwendungen verstehen wir Geräte resp. Analysesysteme, die die Detektion des Amplifikates während seiner Synthese erlauben. Die Amplifikate werden nach jedem abgeschlossenen Temperatur-Zeit Zyklus automatisch meist mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen gemessen. Einerseits kann ähnlich der Ethidiumbromidfärbung beim Agarosegel die synthetisierte DNA mit interkalierenden Farbstoffen (Z.B. SybrGreen) gemessen werden. Anderseits ist der Einsatz von markierten Sonden üblich, der analog der Hybridisierung zu einem spezifischen Nachweis der gebildeten DNA führt. Bei Real Time PCR Systemen fallen somit normalerweise die Detektionsarbeiten nach der PCR weg. Ein weiterer Vorteil liegt im Zeitaufwand pro Analyse. Bei Systemen mit Glaskapillaren kann eine Analyse bereits nach einer Stunde beendet sein (LightCyclerTM).
Die bekanntesten und am meisten angewendeten Real Time Systeme sind TaqManTM von Applied Biosystem und LightCyclerTM von Roche.